跳过主要内容

Primer-BLAST:为聚合酶链反应设计靶特异性引物的工具

抽象的

背景

选择合适的引物可能是影响聚合酶链反应(PCR)的一个最重要的因素。目标物的特异性扩增要求引物在特定方向和特定距离内不能与其他目标物相匹配,从而允许不期望的扩增。设计特定引物的过程通常包括两个阶段。首先,利用人工或软件工具生成感兴趣区域两侧的引物;然后,利用BLAST等工具对相应的核苷酸序列数据库进行搜索,以检查潜在的目标。然而,后者的过程并不容易,因为需要检查引物与目标物之间的许多细节,如匹配的碱基的数量和位置、引物的方向以及正反引物之间的距离等。这种分析的复杂性通常会让用户非常费时和困难,特别是当引物有大量的点击量时。此外,尽管BLAST程序被广泛用于引物目标检测,但实际上它并不是一个理想的工具,因为BLAST是一种局部对齐算法,并不一定返回整个引物范围的完全匹配信息。

结果

我们提出了一种新的软件工具,称为Primer-BLAST,以减轻设计靶特异性引物的困难。该工具将BLAST与全局比对算法相结合,以确保引物与目标的完全比对,并具有足够的灵敏度来检测与引物有大量不匹配的目标。Primer-BLAST允许用户一步设计新的靶向引物,也可以检查已有引物的特异性。Primer-BLAST还支持基于外显子/内含子位置放置引物,并排除引物中的单核苷酸多态性(SNP)位点。

结论

我们描述了一种强大而完全实现的通用底漆设计工具,用于设计特定于目标的PCR引物。PRIMER-BLAST提供灵活的选项来调整特异性阈值和其他底漆属性。此工具可公开提供http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

背景

PCR是生物医学研究、诊断检测和法医鉴定等领域常用的DNA扩增方法。虽然PCR的结果会受到许多其他条件的影响,如模板DNA的制备和反应条件,设计一对好的引物是一个关键因素。一般要求是,底漆的熔化温度(Tm)相近,G/C含量平衡,但应避免自互补和发夹结构。在某些情况下还可能适用其他要求。例如,为了避免反转录PCR (RT-PCR)中基因组DNA的不必要扩增,建议一个引物对跨越一个内含子,或者其中一个引物位于一个外显子-外显子连接处。另一个担忧是snp在引物区域可能产生的影响。由于SNP在某些情况下可能起到不匹配的作用,我们应该考虑选择这些区域以外的引物。

引物的一个关键特性是目标特异性。理想情况下,一对引物只能放大预期的目标,而不是任何非预期的目标。这对于实时定量PCR (qPCR)尤其重要,因为在许多情况下,PCR产物的数量是由扩增DNA中纳入的荧光总强度表示的,任何非预期目标的扩增都可能影响测量[1].由于染色体或转录物的不同部分可能与同源区域或偶然的匹配引起的一些核苷酸相似性,因此对于一个靶标的引物对也不罕见,其对一个靶的引物对也将结合另一个目标,导致非特异性的靶扩增。

许多研究已经调查了目标和引物不匹配的影响,并表明即使目标与引物有一些不匹配,它也可以被放大[2-5].一般情况下,3′端失配对靶标放大的影响远大于5′端失配。虽然这些研究的结果各不相同,而且很难确定错配和扩增之间的确切关系,但共识是3 '端两个碱基错配通常会阻止扩增。单个碱基不匹配(即使是在非常3 '端),以及在中间或接近5 '端有一些不匹配,仍然允许扩增,尽管在某些情况下会降低效率。给定的变量影响不匹配和用户可能有不同的标准的可能性根据自己的实验条件,重要的是,应该提供一个软件工具能够检测到一些不匹配整个底漆和灵活地改变特异性设置范围。在这方面,值得指出的是,BLAST程序[6]实际上并不是实现这一目的的理想工具,因为它使用了局部对齐算法,并不一定返回引物和目标之间的完全匹配信息,特别是在引物末端匹配不完美的情况下。

许多公共软件工具已经被开发来帮助初级设计过程。值得注意的是,广泛使用的Primer3程序[7]根据各种参数设计引物。由于它不执行目标分析,用户通常需要使用其他工具测试引物特异性。然而,如果引物有太多的数据库匹配(例如BLAST搜索),这个过程很耗时,有时甚至不切实际。

一些软件程序,如in - silica PCR [8]及反向ePCR [9],不设计引物,而是确定用户提供的引物对扩增目标。然而,即使有这些工具的帮助下,寻找特异性引物仍然是一个艰难的过程,因为用户经常需要手动完成许多候补引。此外,由于这些软件工具大多使用基于索引的策略,这就要求搜索数据库的计算密集的预处理,它们是由数据库的可用性的限制,通常是不够敏感,以检测具有的显著数量目标错配引物又是潜在的扩增。

因此,希望将引物设计要求的各种元件组合成一个过程,使得用户可以简单地输入模板并获得所需的目标特异性引物。有几个现有程序已解决此问题的某些方面。自动血清[10.]设计了跨越外显子连接或内含子的引物,这样引物只针对mRNA。然而,它没有解决引物特异性的问题。QuantPrime [11.是设计用于实时PCR检测mRNA的靶特异性引物的专用工具。同样,PRIMEGENS序列特异性引物设计工具[12.]也可以用于特定的引物设计为生物体的数量有限。However, neither of these tools guarantees an accurate count of nucleotide matches between primer and target due to the fact that they both use a local alignment algorithm (i.e., BLAST) alone for the similarity search and thus may miss part of an alignment between primer and target [6].这些工具中的其他限制包括低目标检测灵敏度,有限的特异性严格选择,基于外显子/内含子边界要求和搜索数据库中有机体的覆盖范围有限的设计引物的支持或有限的支持。

我们开发了Primer-BLAST作为通用公共工具,帮助用户设计特定目标的引物。blast底漆提供了灵活性,以适应不同的底漆设计需求。用户既可以设计新的引物,也可以检查已有引物的特异性。值得注意的是,Primer-BLAST整合了一个全局比对机制,在检测潜在扩增目标时非常敏感。最后,它有能力根据外显子/内含子边界和SNP位置来放置引物。我们还没有发现其他通用公共工具集成了类似的功能来设计特定目标的引物。

执行

primer - blast程序由一个生成候选引物对的模块和一个检查生成引物对的目标特异性的模块组成。Primer3用于生成给定模板序列的候选引物对。特异性检测模块使用BLAST和Needleman-Wunsch (NW)全局对齐算法[13.来寻找引物和目标之间的匹配。Primer-BLAST程序是使用NCBI c++工具包和Primer3 C编程接口实现的,该接口最近增加了将引物靶向到一个或多个特定区域以及指定碱基之间(用于剪接位点规范)的功能。Primer-BLAST程序在NCBI的机器群上运行,为用户提供更快、更可靠的服务。

为了增加找到特异性引物对的机会,如果可能的话,至少有一个引物(对于给定的引物对)应该位于PCR模板与非目标物不具有高度相似性的区域。为此,将PCR模板序列提交给MegaBLAST [14.]用于快速搜索,以识别与用户指定数据库中非预期序列高度相似的区域。然后指示引物3在可能的情况下将至少一个引物(对于给定的引物对)放置在这些区域之外。如果用户提交的模板是RefSeq登录或NCBI-gi, Primer-BLAST从NCBI Entrez数据库中检索与模板相关的外显子/内含子边界以及SNP位点,以满足基于外显子/内含子边界和SNP位点放置引物的需求。

候选引物对随后受特异性检查过程。由于引物3产生许多候选引物对,他们都可能需要进行特异性检查,以获得特定的目标引物对指定的号码,如果每对中搜索与BLAST个别整个搜索过程可能会很长。为了解决这个问题,我们观察到任何底漆本质上是PCR模板的子区域,并使用模板作为查询应该包含所有引物对定位信息的单一BLAST结果。其结果是,当用户提供一个模板序列设计新的引物(模板的情况下),模板本身被提交BLAST搜索只有一次,大大降低了总的搜索时间。对于其中用户提交一个预先存在的引物对来进行特异性检查(唯一的引物 - 的情况下)的情况下,对于与N的的20个碱基的间隔区连接两个引物的BLAST检索产生的人工模板序列。这确保了每个引物会在BLAST搜索分开处理,从而实现了执行用于每个引物的单独BLAST搜索的等效效果。为了进一步减少搜索时间,不包含候补引模板上的所有区域被屏蔽掉,以避免不相关的BLAST命中。由于该模板的所有候补引位置由引物3已经建立,为所有对引物扩增目标(扩增子)可以使用上述单BLAST结果来确定。引物对被认为是唯一的,如果它有比由用户指定的特异性检查阈值之内提交的模板以外的任何目标,没有具体的扩增。否则,将被视为非特异性。 In addition to checking for amplicons between the forward and the reverse primers, Primer-BLAST also checks amplicons arising from either primer alone. For example, the forward primer could also act as a reverse primer if it happens to match some regions on the minus strand of the template.

默认情况下的特异性检查模块使用BLAST搜索参数,以确保高灵敏度,使其可以检测到最多35%的不匹配到引物序列的目标。默认爆炸预期值截止为底漆的案例为30,000,并且通常调整模板箱的更高(见下文)。这种预期值比标准BLAST程序的默认值高3000倍(预期值截止值越高,搜索越敏感),以确保检测到对引物具有大量不匹配的靶标的目标在PCR中可能是可扩增的目标.其他高度敏感的默认参数包括七个(标准BLAST使用11)的字大小,50,000,用于最大数据库序列数(标准BLAST使用250)和1,用于匹配奖励以错配罚分(标准BLAST使用1.5)。在引物和目标之间给定的爆炸匹配的预期值与给定相同的搜索数据库的查询序列长度大致成比例[6]但是在唯一的逻辑外壳和模板案例中使用的查询长度通常非常不同。因此,即使相同的引物序列对准,在两种情况下,在两种情况下的爆炸匹配之间的值可能存在大的差异。若要解决此问题,我们在内部调整指定的预期值截止的模板案例,使用人工模板的长度从唯一的逻辑案例作为指导。这可确保BLAST结果在提交模板和提交引物之间等同于。

由于需要在引物和目标物之间进行完全对准以进行精确的特异性检查,因此NW全局对准算法[13.]掺入引物-BLAST重新调整未完全通过BLAST对齐的任何区域。

结果与讨论

用户界面

所述接口包括几个部分,其中用户可以输入的PCR模板和/或预先存在的引物以及其它用户可调节的参数(图 1).

图1
图1

底漆-BLAST Web界面。

用户可以通过单独输入DNA模板或通过输入模板加上其他预先存在的引物来设计一个底漆来设计新的引物对。底漆可以检查有或没有模板的预先存在引物的特异性。PCR模板可以是Fasta格式的原始DNA序列或NCBI加入。如果可用,建议使用Refseq访问,因为它带有有关序列的更多信息[15.],允许引物-BLAST以更好地识别模板,并由此更好地执行引物的特异性检测。引物-BLAST还上的任何原始序列输入执行快速检查,以确定它是否是一个完全匹配的RefSeq序列,在这种情况下引物-BLAST将使用RefSeq登录作为模板。模板长度被限制在50,000个碱基。对于更长的模板,引物范围(图的右上角 1)应用于限制长度。

Primer-BLAST还提供了基于外显子/内含子结构设计引物的能力,以便更好地针对mRNA进行PCR扩增。用户可以指定引物是否应该跨越外显子/外显子连接,连接两端的碱基数量可调,以及引物对是否应该跨越内含子,并可选择指定内含子大小。由于该选项依赖于精确的外显子/外显子边界注释,因此需要RefSeq登录(作为PCR模板),因为RefSeq代表NCBI最佳的筛选序列类别。

几个数据库选项可用于广泛的生物覆盖的特异性检查。其中包括RefSeq mRNA数据库和RefSeq基因组数据库,截至2011年11月18日,这两个数据库分别包含226个和7546个生物体。这些数据库是非冗余的,因为它们不会重复覆盖相同的序列区域,因此允许更好的特异性检查。它们是设计新的靶向引物的首选数据库。包含冗余条目的传统nr数据库也可用,主要推荐用于其他数据库没有涵盖的生物体或RefSeq数据库没有涵盖的序列条目。

底漆-BLAST提供了灵活的特异性的严格选择。用户可以指定的引物对必须具有意想不到的目标,以及在哪里这些不匹配,必须存在一个3’ 末端区域的错配的数目。此外,用户可以指定不匹配的阈值,高于该任何目标应该被忽略(即,滤除目标具有太多的错配是用于非特异扩增关注)。The default specificity settings are that at least one primer (for a given primer pair) must have two or more mismatches to unintended targets in the last five bases at the 3’ end, and that any targets with six mismatches or more to at least one primer (for a given primer pair) should be ignored.

当外显子的差异不足以区分一个剪接变体mRNA时,并不总是可能产生针对特定剪接变体mRNA的引物。因此,Primer-BLAST提供了剪接变体处理选项,允许来自同一基因的其他变体的扩增。

其他选项,包括BLAST搜索灵敏度,SNP排斥和引物性等参数可以在“高级参数”部分中找到。

演讲的结果

结果页面报告的所生成的引物,在每个引物对的专一性,相对于PCR模板,并且某些特征的引物对,例如外显子的一个图形总结,以及详细信息。它只会显示靶特异性引物,如果发现;否则,将报告所有引物。在所有的情况下,实际的目标,将与引物和目标之间的详细比对上市沿。

以人锌指蛋白419 (ZNF419)转录本变异5 mRNA (Genbank accession NM_001098494)为例,设计了引物,说明了引物的功能。如图所示2,根据NCBI基因报告,存在ZnF419基因的七种转录变体。搜索使用至少一个引物(对于给定引物对)的默认值,以在3'结束的最后五个基座中具有两个或多个不匹配的非预期目标。对NCBI Refseq mRNA数据库进行特异性检查,其生物体限于人,因为目标是发现仅在人转录组中特异于该转录物的引物对。为避免可能的基因组DNA扩增,选择“引物必须跨越外显子结”。如图所示3.,底漆-BLAST成功返回五个具体引物对和目标,引物之间的详细排列显示。在搜索过程中,引物-BLAST共有355744个BLAST匹配检查(参见图 3.(图例),它们不仅代表该基因的转录本变异,而且还代表其他基因的大量转录本,这些转录本与候选引物在不同程度上匹配。这就突出了一个挑战,如果同样彻底的检查引物特异性任务是手动执行。使用平均长度(2800-3000个碱基)的人mRNA模板设计具有默认参数的新引物,平均搜索时间为2.6分钟。

图2
图2.

ZNF419基因mRNA转录变体的示意图比对。数字表示变体5的外显子的结束位置。红线表示引物爆炸挑选的引物区域。注意,即使它们共享相同的外显子(即变型2 V.S.变体1,变体7 V.S.变体6和变体4 V.S.变体4,变体7 V.S.变体6和变体4 V.S.变体4 V.S.变体3),几种转录物也因使用略微不同的接头位点而异。该图表适应NCBI基因报告(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=79744.数据访问11/02/2011)。

图3
图3.

设计目标特异性引物的示例结果。请注意,当5个引物对被返回(如图图形摘要),由于空间限制,仅对于第一引物对中的图所示的信息。“搜索摘要”链接,点击时,示出了用作以及被在搜索过程中产生的BLAST命中总数(355744次命中为当前搜索)搜索参数。比对中的数字表示的引物和目标的开始和结束位置。点(。)表示对引物序列的核苷酸同一性。搜索已于11/02/2011完成。

转录变体5的与其它变体比对的检查表明,外显子2和外显子缺失4,当组合时的存在,是从静止区分开来的唯一的特征(图 2).不足为奇的是,Primer-BLAST选择的部分或全部正向引物位于外显子2,而所有反向引物位于外显子3和5之间的连接处(因为外显子4不存在)。

底漆-BLAST也可用于检查的预先存在的引物的特异性。作为一个例子,我们获得了相同的PCR模板与上述引物(即,ZNF419转录变体5的mRNA)从PrimerBank,其中沉积物许多预先计算的基因特异性引物,用于检测mRNA的[16.].同样,使用默认的特异性参数,结果显示在图中 4.从Refseq mRNA数据库中搜索的搜索11,236爆炸点击与人类有限公司的有机体,这再次说明了即使对于单个底漆对也难以手动检查爆炸结果。该引物对确实显示出与ZnF419基因转录变体5的完美匹配以及来自同一基因的其他转录变体,并产生444个基础扩增子。这与Primerbank的选择标准一致,即引物仅在基因水平处特异,而不是在转录水平。有趣的是,还检测到一些其他潜在的扩增子。一种是预期ZNF419转录物中存在的另外的780个基础扩增子。另一种是来自不同基因的444个基础扩增子(即人锌指蛋白773,Genbank登录NM_198542.1)。然而,在至少一个引物和靶标之间存在高达5个不匹配,这可能足以防止扩增干扰或非特异性扩增。尽管如此,用户可以根据自己的实验经验仔细审查这一结果并判断。

图4
图4.

预先存在的引物特异性检查。通过在不输入任何模板的情况下进入前向和反向引物来执行此搜索。引物(正向底漆:GTAGGACTGCTCAGTTCAACAT,反向引物:ACAGTTACTACACCCGTAAGGC)是从PRIMERBANK获得的(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)在11/02/2011使用ZNF419转录变体5 (GenBank登录NM_001098494)。虽然结果显示ZNF419基因的7个转录变体都有相同的扩增子,但由于篇幅的限制,此图仅显示了变体1和5的详细信息。目前的搜索产生了11236 BLAST点击(完成于11/02/2011)。

相较于其他的引物设计工具

Primer-BLAST提供了许多其他软件工具无法提供的功能。表1简要总结这些特性,其中许多特性对各种引物的设计要求很重要,并允许用户检查引物特异性细节。例如,primer - blast是唯一能够指定特定引物对对非目标所必须具有的错配数量的工具,以及必须存在一定数量错配的自定义3 '端区域。这个选项对于满足用户不同的引物特异性严格要求很重要,由于引物的特异性通常是由它对非目标物的错配数量(错配数量越多越有特异性)和错配的位置(越接近3 '末端的错配越有特异性)来判断的。Primer-BLAST是这三种程序中唯一一个将引物放置在不同的外显子上(即跨越一个内含子)以避免基因组DNA扩增的程序,也是唯一一个允许自定义外显子/外显子连接两边的核苷酸匹配数量的程序。此外,Primer-BLAST给出了所发现的引物和目标之间的详细排列。

表1比较不同底漆设计工具的选定特征

引物-BLAST的另一个优点是它的高的检测灵敏度。如上所示,引物-BLAST是,默认情况下,能够检测具有多达5个错配的引物扩增的潜在靶标。引物高炉利用高度敏感的爆破参数,以及额外的NW全局比对算法,以确保底漆和目标之间的完全对齐实现这种效果。然而,需要注意的就是BLAST算法[6]在查询和目标之间需要最小的核苷酸匹配(Word大小)以及使用爆炸作为搜索算法的任何工具都受到此限制。因此,PRIMER-BLAST(带默认参数)会错过与引物有6个或更少的连续匹配的目标(因为默认情况下,使用字大小为7)。For example, if a target has mismatches to a primer of 20 bases at positions 7 and 14 (assuming the 5’ end is position one), the target will be missed by Primer-BLAST (with default parameters) even though it has only 2 mismatches. Assuming a random distribution of mismatch locations, it is possible to calculate the number of possible arrangements of 18 matches and 2 mismatches. There are 20*19 different ways to place the 2 mismatches among the 18 matches, but only 2 of these result in a word size shorter than 7, so the probability of missing a target with 2 mismatches to a primer of 20 bases is 2/(20*19) or about 0.5%.

接下来我们比较primer - blast与其他引物设计工具(如QuantPrime和PRIMEGENS)的目标检测灵敏度。理想情况下,检测灵敏度的比较是使用第三方生成的引物(例如,由Primer3生成的引物)直接测试所有工具的特异性检查模块。不幸的是,这个选项是不可用的,因为Primer-BLAST是唯一直接提供特异性检查的工具(即,预先存在的引物的特异性检查)。作为替代,我们使用QuantPrime和PRIMEGENS设计针对靶标的引物,然后使用Primer-BLAST对这些引物进行潜在靶标的检测。如果Primer-BLAST没有找到预期目标以外的目标(即输入的mRNA模板本身),那么可以得出结论,QuantPrime和PRIMEGENS至少与Primer-BLAST一样敏感。另一方面,如果Primer-BLAST发现的非预期靶标存在,则说明这些工具在靶标检测灵敏度上不如Primer-BLAST灵敏(因为这些工具已经检测过这些靶标,但在选择靶向引物的过程中无法避免)。

测试模板从NCBI Refseq mRNA数据库中随机选取,其中包括52条用于测试QuantPrime的人类序列和24条用于测试PRIMEGENS的拟南芥序列(因为PRIMEGENS不支持人类序列)。如表所示2,QuantPrime或Primegens生成引物对,以便最多的测试用例,它们认为是特定的输入模板。然而,引物爆炸揭示了其中许多(来自量子素的13.4%的引物对和来自Primegens的43.3%的引物对)具有潜在的意外靶标,其在一个和五个核苷酸错配之间显示。结果,大部分的测试病例具有至少一种引物对,其具有潜在的意外靶标(量子级为31.5%,PRIMEGENS的31.5%)。一些靶标在QuantPrime(18.5%)产生的引物中只有一个或两个错配(18.5%),尽管该部分对于PRIMEGENS(3.4%)小得多。

表2.QuantPrime和PRIMEGENES报道的潜在非预期引物对靶标综述一个

5显示5个潜在的非预期目标的细节。例如,QuantPrime生成了两个引物对(例1和例2),分别针对Genbank收录的NM_182690.2和NM_001039567.2(图1)5).然而,Primer-BLAST揭示了这两对基因都有潜在的非预期靶标NM_005227.2和NM_001008.3,它们与正向引物或反向引物只存在一个核苷酸错配。由PRIMEGENS生成的引物对(例4)也显示了潜在的非目标,只有一个不匹配。如前所述,单个核苷酸错配(即使在3 '端)并不会显著影响靶标扩增,因此这些引物对不太可能是特定的。在(例1中的核苷酸碱基G)或靠近3 '端(例2中的核苷酸碱基C)的地方未能检测到单个碱基不匹配,这表明仅使用局部对齐算法的缺点。局部对齐试图最大化它返回的分数,所以它将不包括在或(可能)接近对齐结束时的不匹配,因为它们会降低总体分数[6].其他有意义的靶的病例包括2个错配(实施例3),或5个错配(实施例5)到其中一个引物。

图5
图5.

由QuantPrime和PRIMEGENS生成的引物对的潜在非预期目标的例子。从QuantPrime或PRIMEGENS生成的引物对的primer - blast特异性检测结果中提取示例靶标(QuantPrime和PRIMEGENS共识别出162和116个潜在非预期靶标)。见表2有关详细信息)。示例引物对应于附加文件中下划线的那些12

因此,我们得出结论,引物 - 爆炸能够检测在特异性筛查过程中被量子级或血液生成的潜在意外的目标。

结论

primer - blast是一种通用的靶向PCR引物设计工具,具有其他工具所没有的灵敏度和可用性。它提供了灵活的选项来满足各种特异性严格要求和使用一个爆炸搜索(局部比对)快速识别尽可能多的目标,但是,一个全局比对得到一个准确的数不匹配整个底漆当爆炸比对仅覆盖部分引物长度。Primer-BLAST在NCBI的机器群上运行,为用户提供更好的服务。输入可以是Genbank登录、FASTA文件,甚至是来自其他来源的引物。它还利用NCBI序列数据库的丰富信息来支持其他需求,如基于内含子/外显子边界和SNP位置放置引物。最后,它显示找到的引物和目标之间的比对,允许用户在存在潜在的非预期目标时决定是否使用引物对。

可用性和需求

项目名:底漆爆炸

项目主页:188体育投188体育投注http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

操作系统):平台无关的

编程语言:C ++

其他需求:Web浏览器

执照:底漆 - BLAST Web工具可免费提供所有用户。BLAST搜索和底漆特征检查的源代码在公共领域[17.]并且在NCBI C ++工具包提供。引物3是在GNU通用公共许可证v2的下开源的形式免费提供。

非学者使用的任何限制:没有一个

参考

  1. 1。

    Vanguiller HD,Vraane Ke,Freeman WM:对基因表达分析的二十五多年的定量PCR。生物技术。2008,44(5):619-626。

    文章CAS.PubMed谷歌学术

  2. 2.

    而DM、Sloots TP:引物靶序列的变化影响病毒定量PCR的准确性。临床病毒学杂志,2005,34(2):104-107。10.1016 / j.jcv.2005.02.010。

    文章CAS.PubMed谷歌学术

  3. 3.

    Sipos R, Szekely AJ, Palatinszky M, Revesz S, Marialigeti K, Nikolausz M:引物不匹配、退火温度和PCR周期数对16s rRNA基因靶向细菌群落分析的影响。微生物学报,2007,60(2):341-350。10.1111 / j.1574-6941.2007.00283.x。

    文章CAS.PubMed谷歌学术

  4. 4.

    瀑布CM, Eisenthal R, Cobb BD:等位基因特异性PCR中引物不匹配的动力学特征:定量评估。生物化学学报。2002,29(5):715-722。10.1016 / s0006 - 291 x (02) 02750 - x。

    文章CAS.PubMed谷歌学术

  5. 5.

    Ghedira R,Papazova N,Vuylsteke男,Ruttink T,Taverniers我,德松散L:对目标类群为GMO定量的实时PCR扩增引物/模板不匹配的效果评估。JAgric Food Chem。2009年,57(20):9370-9377。10.1021 / jf901976a。

    文章CAS.PubMed谷歌学术

  6. 6.

    Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ: gap BLAST和psp -BLAST:新一代蛋白质数据库搜索程序。中国生物医学工程学报,2017,31(4):531 - 534。10.1093 / nar / 25.17.3389。

    pmed中央文章CAS.PubMed谷歌学术

  7. 7.

    Rozen S,Skaletsky H:PRIMOR3关于一般用户和生物学家程序员的WWW。方法Mol Biol。2000,132:365-386。

    CAS.PubMed谷歌学术

  8. 8。

    in - silica PCR:,,http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start

  9. 9。

    Rotmistrovsky K,Jang W,Schuler Gd:用于执行电子PCR的Web服务器。核酸RES。2004,32(Web服务器问题):W108-W112。

    pmed中央文章CAS.PubMed谷歌学术

  10. 10。

    Wrobel G, Kokocinski F, Lichter P: AutoPrime:筛选表达序列的引物。生物谷bioon . 2004, 5: P11-10.1186/gb-2004-5-5-p11。

    文章谷歌学术

  11. 11.

    阿维德森S,涅夫斯基男,里亚尼奥-帕琼DM,缪勒 - Roeber B:QuantPrime-一个可靠的高通量的引物设计用于定量PCR的灵活的工具。BMC Bioinforma。2008年,9:465-10.1186 / 1471-2105-9-465。

    文章谷歌学术

  12. 12.

    PRIMEGENS:,,http://primegens.org/w3/w32/w3_html/SSPD.html

  13. 13.

    Needleman SB, Wunsch CD:一种用于寻找两个蛋白质氨基酸序列相似性的通用方法。中国生物医学工程学报,2017,48(3):443-453。10.1016 / 0022 - 2836(70) 90057 - 4。

    文章CAS.PubMed谷歌学术

  14. 14.

    张Z,施瓦茨S,瓦格纳L,米勒宽:贪婪算法用于对准的DNA序列。ĴCOMPUT生物学。2000年,7(1-2):203-214。

    文章CAS.PubMed谷歌学术

  15. 15.

    Pruitt KD, Tatusova T, Klimke W, Maglott DR: NCBI参考序列:现状,政策和新举措。核酸学报2009,37(数据库版):D32-D36。

    pmed中央文章CAS.PubMed谷歌学术

  16. 16.

    Wang X, Wang H, Wang H . Seed B: primer bank:一种用于基因表达检测和定量的人及小鼠PCR引物。核酸Res. 2010, 38(数据库版):D792-D799。

    pmed中央文章CAS.PubMed谷歌学术

  17. 17.

    关于NCBI的公共领域通知:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=toolkit&part=toolkit.fm#A3

下载参考

确认

作者要感谢Christiam卡马乔,约什 - 樱桃,彼得·库珀,迈克尔DiCuccio,保罗·基茨,大卫·利普曼,韦恩Matten,斯科特·麦金尼斯,尤里Merezhuk,吉姆Ostell,严Raytselis,埃里克·塞耶斯,格雷格·舒勒,陶陶,以及如在NCBI的C ++工具包组的成员,对他们的工作已经作出该工具可能。这项研究是由美国国立卫生研究院院内研究计划,国家医学图书馆的支持。SR和IC是由卫生部新加坡卫生部和原子能机构的科学,技术和研究支持。

作者信息

隶属关系

作者

通讯作者

对应于叶剑

附加信息

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

所有作者都参与了软件的设计和编码。JY起草了手稿,所有作者阅读并批准了手稿的最终版本。

电子补充材料

12859 _2012_5274_moesm1_esm.doc

附加文件1:PrimerPairsFromQuantPrime.doc从QuantPrime生成的引物对。从NCBI Refseq mRNA数据库中随机选择52个人类模板序列,使用QuantPrime生成靶特异引物。选择“SYBR Green real-time qPCR (no splice variant hits)”选项,将生物体设置为人类,数据库设置为“RefSeq 04/30/09 (reference assembly)(genome+) (splice variant)”。所有其他选项都使用默认值。图中带下划线的对用作示例案例5.(医生79 KB)

12859_2012_5274_moesm2_esm.doc.

附加文件2:PrimerPairsFromPRIMEGENS.doc从PRIMEGENS生成的引物对。从NCBI Refseq mRNA数据库中随机选取24个模板序列,利用PRIMEGENS生成靶特异引物(拟南芥序列由于PRIMEGENS不支持人类转录本数据库,所以选择Arabidopsis thaliana序列)。选择数据库“拟南芥TAIR9 cDNA”。所有其他选项都使用默认值。图中带下划线的对用作示例案例5.(DOC 157 KB)

作者为图像提交的原始文件

权利和权限

本文由BioMed Central Ltd授权发表。188bet金博宝欧洲杯哪里能买球这是一篇基于知识共享署名许可协议(http://creativeCommons.org/licenses/by/2.0.),允许在任何媒介上无限制地使用、分发和复制,但必须正确引用原作。

重印和权限

关于这篇文章

引用这篇文章

耶,J,库鲁里斯,G, Zaretskaya, I。et al。Primer-BLAST:为聚合酶链反应设计靶特异性引物的工具。www.188bet com13,134(2012)。https://doi.org/10.1186/1471-2105-13-134

下载引用

关键字

  • 转录变体
  • 单核苷酸多态性位置
  • 聚合酶链反应模板
  • 特异性检查
  • 单核苷酸不匹配